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非洲豬瘟作為養(yǎng)豬業(yè)的重大威脅，其快速準確檢測至關重要。PCR熒光檢測儀憑借其高靈敏度和特異性，成為防控非洲豬瘟疫情的關鍵工具。有些用戶在使用非洲豬瘟檢測儀時常會遇到一些問題，今天來給大家解答并講講需要注意的事項。
一、樣本采集與處理
Q1：如何確保樣本采集的規(guī)范性？
無菌操作：使用一次性真空采血管，采樣部位需酒精消毒后采集，避免樣本污染。
采樣部位：優(yōu)選耳緣靜脈血（抗凝管）、腹股溝淋巴結或扁桃體組織，確保樣本代表性。
冷鏈運輸：樣本需4℃保存，24小時內送達實驗室，防止核酸降解。
Q2：樣本處理中有哪些污染防控措施？
環(huán)境控制：在BSL-2實驗室操作，使用超凈工作臺或生物安全柜。
試劑準備：試劑平衡至室溫后使用，避免反復凍融導致效價下降。
陰性對照：每批次設置3個陰性對照，監(jiān)測實驗室污染。
二、檢測操作規(guī)范
Q3：PCR反應體系構建需注意哪些細節(jié)？
加樣順序：模板RNA→預混液→酶→探針，避免氣泡產生。
分裝要求：使用8聯(lián)管分裝，每孔總體積20μL，確保反應均一性。
陽性對照：設置強弱陽性對照（1×103、1×10?、1×10?拷貝/μL），驗證檢測效能。
Q4：擴增程序設置的關鍵參數(shù)有哪些？
預變性：95℃ 5min，激活Taq酶。
循環(huán)參數(shù)：95℃ 15s（變性）→60℃ 45s（退火延伸），40個循環(huán)。
熔解曲線：60℃→95℃（升溫速率0.5℃/s），驗證產物特異性。
三、結果判讀與異常處理
Q5：如何解讀擴增曲線和Ct值？
陽性標準：Ct值≤35，且呈典型S型擴增曲線。
可疑樣本：Ct值35-40需復檢，建議改用巢式PCR驗證。
陰性結果：需排除采樣不當或樣本保存問題。
Q6：檢測結果出現(xiàn)“翹尾”現(xiàn)象如何處理？
初步處理：復查原有樣本，重新提取核酸驗證。
深入排查：若仍出現(xiàn)“翹尾”，需做環(huán)境樣本和陰性對照，排除實驗室污染。
臨床驗證：結合病豬臨床癥狀，必要時重新采樣復查。
四、實驗室管理要點
Q7：如何防止實驗室污染？
單向操作流：試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)（氣壓遞減）。
耗材處理：使用無核酸酶槍頭，經(jīng)UV照射后使用。
環(huán)境消毒：實驗后使用專用核酸祛除劑消毒臺面和設備。
Q8：儀器維護與校準有哪些要求？
定期校準：每日進行熒光本底檢測，每周進行溫度驗證。
軟件升級：定期更新分析算法和軟件補丁，提升檢測精度。
記錄保存：詳細記錄實驗條件、試劑批號、操作者等信息，確保結果可追溯。
五、特殊場景應對策略
Q9：環(huán)境樣本檢測不出內標的原因？
技術原理：非洲豬瘟試劑檢測豬內源性內標，環(huán)境樣本可能不含豬源細胞。
偶發(fā)檢出：可能因環(huán)境樣本黏附豬源性細胞，需結合流行病學調查綜合判斷。
Q10：檢測結果與臨床診斷不符如何處理？
系統(tǒng)分析：考慮“窗口期”、取樣部位、送檢時間等因素。
方法驗證：采用不同試劑復檢，或結合ELISA、生物學檢測方法綜合判斷。
動態(tài)監(jiān)測：對可疑豬群進行連續(xù)監(jiān)測，觀察病毒載量變化趨勢。
通過嚴格執(zhí)行標準化操作流程，結合質量控制措施，可確保非洲豬瘟PCR熒光檢測結果的準確性和可靠性。建議實驗室定期參加能力驗證，持續(xù)提升檢測水平，為非洲豬瘟防控提供堅實的技術支撐。
TH-H480熒光定量PCR非洲豬瘟檢測儀
